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工业循环冷却水中硫酸盐还原菌的测定 GB/T 14643.5-93

发布:多吉利        来源:www.duojili.cn  

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准

工业循环冷却水中硫酸盐还原菌的测定 GB/T 14643.5-93

MPN法

Industrial circulating cooling water-Sulfate-reducing bacteria-MPN test

1 主题内容与适用范围

本标准规定了工业循环冷却水中硫酸盐还原菌的测定方法。

本标准适用于工业循环冷却水中硫酸盐还原菌的测定,也适用于原水、生活用水及粘泥中硫酸盐还原菌的测定。 

2 引用标准

GB 603 化学试剂 试验方法所用制剂及制品的制备

GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 方法提要

本法采用多试管发酵技术,在29±1℃培养21d,如果试管内产生黑色沉淀并伴有硫化氢臭味的表明阳性反应,采用MPN技术对被测试样中的硫酸盐还原菌进行计数。 

4 试剂和材料

本试验方法中,除特殊规定外,应使用分析纯试剂和符合GB 6682中三级水的规格。 

4.1 磷酸氢二钾(HG 3—1228); 4.2 氯化铵(GB 658); 4.3 硫酸钠(GB 9853);   4.4 氯化钙; 4.5 硫酸镁(GB 671); 4.6 乳酸钠; 4.7 酵母汁:生化试剂; 4.8 硫酸亚铁铵(GB 661); 4.9 维生素C; 4.10 氯化钠(GB 1266); 4.11 氢氧化钠(GB 629):40g/L溶液; 4.12 盐酸(GB 622):1+11溶液;

4.13 硫代硫酸钠(GB 637); 4.14 乙醇(GB 678):75%(V/V)溶液; 4.15 牛皮纸; 4.16 医用脱脂棉。

5 仪器和设备

5.1 无菌箱(室)或超净工作台; 5.2 蒸汽压力灭菌器; 5.3 生化培养箱; 5.4 电热干燥箱:温度可控制在(60~280)±2℃; 5.5 电热恒温水浴锅:恒温范围(37~100)±1℃; 5.6 刻度吸管:1mL; 5.7 刻度吸管:5mL; 5.8 试管:150mm×15mm并配上密封的塞子; 5.9 试管架; 5.10 刻度三角瓶:500mL; 5.11 磨口三角瓶:100mL; 5.12 磨口试剂瓶:1000mL; 5.13 容量瓶:1000mL。

6 试验前准备

6.1 无菌水的制备

将水分装在100mL磨口三角瓶中,每瓶40mL,每个三角瓶塞子和瓶口间插入一小纸片来防止粘连,每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎,以防污染,用蒸汽压力灭菌器121±1℃灭菌15min。

6.2 培养基的制备。

6.2.1 称取下列试剂:磷酸氢二钾 0.5g;氯化铵 1.0g;硫酸钠 0.5g;氯化钙 0.1g;硫酸镁 2.0g;乳酸钠 3.5g;酵母汁 1.0g;

将上述试剂溶解在1000mL水中,用氢氧化钠溶液(4.11)或盐酸溶液(4.12)调节pH至7.2.±0.2,并分装在500mL刻度三角瓶中,每瓶不超过350mL,瓶口塞上棉塞,并用牛皮纸包好,用蒸汽压力灭菌器121±1℃灭菌15min。

6.2.2 硫酸亚铁溶液:在培养基使用的当天称取1.2g硫酸亚铁铵,在无菌箱(室)内均匀地摊在离紫外线灯30cm处灭菌30min,在无菌操作下,把硫酸亚铁铵溶解于事先准备好的无菌水(6.1)中,混匀。

6.2.3 维生素C溶液:在培养基使用的当天称取0.4g维生素C,在无菌箱(室)内均匀地摊在离紫外线灯30cm处灭菌30min。在无菌操作下,把维生素C溶解于事先准备好的无菌水(6.1)中,混匀。

6.2.4 在无菌操作下,按每100mL培养基(6.2.1)各加入1.0mL硫酸亚铁铵溶液(6.2.2)和1.0mL维生素C溶液(6.2.3)。

6.3 无菌稀释水的制备

6.3.1 生理盐水的配制:称取8.50g氯化钠溶解在1000mL水中,混匀。

6.3.2 将生理盐水(6.3.1)分装在100mL磨口三角瓶中,每瓶45mL,每个三角瓶塞子和瓶口间插入一小纸片,塞紧瓶塞,每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染,用蒸汽压力灭菌器121±1℃灭菌15min。

6.4 刻度吸管的灭菌

6.4.1 将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉,棉花量要适宜,长度大约10~15mm,棉花不宜露在口外,多余的棉花可以用火焰烧掉。

6.4.2 每支刻度吸管用1条约40~50mm宽的牛皮纸条,以45°左右角度螺旋形卷起来,吸管的尖端在头部,粗端用多余纸条折叠打结,不使散开。标上度量,若干支扎成一束,置电热干燥箱中,

6.5 试管的灭菌

将洗净并烘干后的试管塞上密封的塞子,数支一捆,每捆管口用牛皮纸包扎,置电热干燥箱中,于160±2℃灭菌2h。

6.6 采样瓶的灭菌

将洗净并烘干后的1000mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸裹好,扎紧,置电热干燥箱中,于160±2℃灭菌2h。

6.7 硫代硫酸钠灭菌

将硫代硫酸钠放在无菌箱(室)内,并均匀地摊在离紫外线灯30cm处灭菌30min。

7 测定步骤

7.1 水样的采集

7.1.1 用无菌采样瓶采集被测样品,在取样过程中,要保护瓶口和颈部,防止这些部分受杂菌污染,瓶内要灌满水样。

7.1.2 若采集的水中有余氯,应在采样前,在无菌操作下,于无菌采样瓶(6.6)中加入硫代硫酸钠(6.7),加入量为每升水样约0.1g。

7.1.3 水样采集后,应立即进行测定,如果在2h内不能进行测定,应把水样放在冰箱中,于4~10℃保存,存放时间不宜超过24h。经冷冻保存后的水样需测定时,从冰箱中取出,于30℃左右活化4~5h,进行测定。

7.2 无菌箱(室)灭菌

把试验所用的无菌培养基、无菌稀释水、无菌吸管等用品放入无菌箱(室)内,打开紫外线灯灭菌30min。

7.3 水样的稀释和接种

7.3.1 水样放入灭过菌的无菌箱(室)(7.2)中,立即用75%(V/V)乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦手,点燃无菌箱(室)内的酒精灯。

7.3.2~7.3.7条操作应在无菌箱(室)内火焰区进行。

7.3.2 选择适宜的稀释度,应使最后一个稀释度接种培养后无硫酸盐还原菌生长,在空白稀释水样瓶(6.3)上标上稀释度数。

7.3.3 用10倍稀释法稀释水样,即用5mL无菌吸管(6.4)吸取5mL水样注入到45mL空白稀释水中充分摇匀,此时稀释度为10-1。

7.3.4 另取一支5mL无菌吸管吸取5mL稀释度为10-1水样注入到第二个稀释水中,充分摇匀,此时稀释度为10-2,依次类推,直至需要的稀释度为止。

7.3.5 将水样(包括稀释水样)分别接种于无菌试管(6.5)中,试管置试管架上,每个稀释度重复接种5管(根据需要也可重复接种3管或4管)每管接种1mL,每接一个稀释度更换一支无菌吸管。

7.3.6 另取一组试管不接水样作为空白。

7.3.7 用事先在水浴上加热至60℃,并迅速冷却到20℃的无菌培养基(6.2.4)灌满试管(7.3.5)(7.3.6)盖上密封盖子。

7.4 培养

在生化培养箱中,于29±1℃培养21d。

8 计数与报告

8.1 凡产生黑色沉淀并伴有硫化氢臭味的表示有硫酸盐还原菌存在,以“+”(阳性)表示,其余试管以“-”(阴性)表示。

8.2 如果空白出现阳性质反应,表明测定过程中有污染,本次测定无效。

8.3 算出10进位稀释管中阳性试管数,以阳性组合指数记录下来。

8.4 在10进位稀释中多于三个稀释度时,阳性组合的指数只需要用其中依次的三个稀释度,对这三个稀释度的决定是先选出5管全部阳性反应的最大稀释度,然后选出其次相连的两个更高的稀释度,算出阳性组合指数(见表例1、2、4)。8.5 若按照8.4规定的原则选出三个稀释度后,有更高的稀释仍然产生一个阳管,就应该将这一个阳性试管并入所选择的最高稀释的阳性结果中(见表1例3)。

8.6 根据阳性组合的指数,查表(附录A)得出最大可能菌数(MPN)除以阳性组合指数的第一位数字的稀释度数,即为每毫升水样中硫酸盐还原菌的菌数(如果每个稀释度重复接种4管或3管,根据阳性组合的指数查附录B表B1或附录C表C1)。 

例表

例次

稀释度、生长情况及阳性试管数

阳性组合指数

报告方式

100

10-1

10-2

10-3

10-4

1

+++++

+++++

++---

-----

-----

520

5.0/10-1=50

5

5

2

0

0

2

+++++

++++-

++---

-----

-----

542

25/100=25

5

4

2

0

0

3

+++++

+++--

+----

+----

-----

532

14/100=14

5

3

1

1

0

4

+++++

+++++

+++++

+----

-----

510

3.5/10-2=3.5×102

5

5

5

1

0

9 精密度

9.1 由于微生物是不稳定的,精确的试验不能实现,精密度表达仅能按MPN程序。

9.2 在样品中细菌的分布是不规则的,有时细菌成倍地吸附到小颗粒上,MPN正确度随着平行管的增加而增加,当使用5个平行管时,每管加1mL样品时测定结的置信度

附   录 A

五个平行管最大可能的菌数

(补充件)

表A1

指数

个/ml

指数

个/ml

指数

个/ml

指数

个/ml

000

0.0

203

1.2

400

1.3

513

8.5

001

0.2

210

0.7

401

1.7

520

5.0

002

0.4

211

0.9

402

2.0

521

7.0

010

0.2

212

1.2

403

2.5

522

9.5

011

0.4

220

0.9

410

1.7

523

12.0

012

0.6

221

1.2

411

2.0

524

15.0

020

0.4

222

1.4

412

2.5

525

17.5

021

0.6

230

1.2

420

2.0

530

8.0

030

0.6

231

1.4

421

2.5

531

11.0

100

0.2

240

1.4

422

3.0

532

14.0

101

0.4

300

0.8

430

2.5

533

17.0

102

0.6

301

1.1

431

3.0

534

20.0

103

0.8

302

1.4

432

4.0

535

25.0

110

0.4

310

1.1

440

3.5

540

13.0

111

0.6

311

1.4

441

4.9

541

17.0

112

0.8

312

1.7

450

4.0

542

25.0

120

0.6

313

2.0

451

5.0

543

30.0

121

0.8

320

1.4

500

2.5

544

35.0

122

1.0

321

1.7

501

3.0

545

45.0

130

0.8

322

2.0

502

4.0

550

25.0

131

1.0

330

1.7

503

6.0

551

35.0

141

1.1

331

2.0

504

7.5

552

60.0

200

0.5

340

2.0

510

3.5

553

90.0

201

0.7

341

2.5

511

4.5

554

160.0

202

0.9

350

2.5

512

6.0

555

180.0

附   录B

四个平行管最大可能的菌数

(补充件)

表B1

指数

个/ml

指数

个/ml

指数

个/ml

指数

个/ml

000

0.0

113

1.3

231

2.0

402

5.0

001

0.2

120

0.8

240

2.0

403

7.0

002

0.5

121

1.1

241

3.0

410

3.5

003

0.7

122

1.3

300

1.1

411

5.5

010

0.2

123

1.6

301

1.6

412

8.0

011

0.5

130

1.1

302

2.0

413

11.0

012

0.7

131

1.4

303

2.5

414

14.0

013

0.9

132

1.6

310

1.6

420

6.0

020

0.5

140

1.4

311

2.0

421

9.5

021

0.7

141

1.7

312

3.0

422

13.0

022

0.9

200

0.6

313

3.5

423

17.0

030

0.7

201

0.9

320

2.0

424

20.0

031

0.9

202

1.2

321

3.0

430

11.5

040

0.9

203

1.6

322

3.5

431

16.5

041

1.2

210

0.9

330

3.0

432

20.0

100

0.3

211

1.3

331

3.5

433

30.0

101

0.5

212

1.6

332

4.0

434

35.0

102

0.8

213

2.0

333

5.0

440

25.0

103

1.0

220

1.3

340

3.5

441

40.0

110

0.5

221

1.6

341

4.5

442

70.0

111

0.8

222

2.0

400

2.5

443

140.0

112

1.0

230

1.7

401

3.5

444

160.0

附   录C

三个平行管最大可能的菌数

(补充件)

C1

指数

个/ml

指数

个/ml

指数

个/ml

000

0.0

201

1.4

302

6.5

001

0.3

202

2.0

310

4.5

010

0.3

210

1.5

311

7.5

011

0.6

211

2.0

312

11.5

020

0.6

212

3.0

313

16.5

100

0.4

220

2.0

320

9.5

101

0.7

221

3.0

321

15.0

102

1.1

222

3.5

322

20.0

110

0.7

223

4.0

323

30.0

111

1.1

230

3.0

330

25.0

120

1.1

231

3.5

331

45.0

121

1.5

323

4.0

332

110.0

130

1.6

300

2.5

333

140.0

200

0.9

301

4.0

附加说明:
本标准由中华人民共和国化学工业部提出。

本标准由化工部天津化工研究院归口。

本标准由南京大学和南京中山水处理公司负责起草。

本标准主要起草人丁美芳、解正宽、蒋振祥、曾昭琪。

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