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氧氟沙星喷雾剂体外杀菌实验方法的改进

发布:多吉利        来源:www.duojili.cn  

氧氟沙星喷雾剂体外杀菌实验方法的改进

摘要:目的  采用微孔滤膜过滤和比浊法测试不同浓度的氧氟沙星喷雾剂稀释液的体外杀菌效果,并与菌落计数法比较我,考察该法的可行性。方法  将自备氧氟沙星喷雾剂分别稀释10\100倍,分别作用于供试绿脓杆菌菌液1530min,然后用微孔滤 膜过滤比浊法测试其杀菌效果,并设备对照组进行比较。在扫描电镜下观察受作用后的菌态的变化。同时用菌落计数法进行比较。结果  微孔滤膜可拦截供试菌,蒸馏水冲洗氧氟沙星作用后的带菌滤膜可视为喷雾剂菌液已无残余。比浊法与菌落计数法相比,可得到等同的实验结果,并且简便、快捷。结论  微孔滤膜过滤和比浊法二者相结合是一种方便、省时、可行的体外杀菌的实验方法。

关键词:氧氟沙星喷雾剂;杀菌作用;微孔滤膜过滤;比浊法;菌落计数法

氧氟沙星是第三代氟喹诺酮类抗菌药物,具有抗菌谱广、杀菌活性强、临床疗效高、与其他种类抗生素很少发生交叉耐药等特点,已广泛应用于临床上的细菌感染。氧氟沙星全身用药易对幼年动物的关节造成制作及与黑色素结合,从而限制了它在儿童等人群的应用范围,其不良反应发生率为3%-10%。为开发出相对更安全、给药更方便的药物新剂型,制备了氧氟沙星喷雾剂制剂,可用于局部鼻炎、扁桃体炎、咽炎、喉炎、口腔炎症及淋病、皮肤烧烫伤及外伤感染的治疗。为难氧氟沙星的抑菌效果,现设计了短时间内氧氟沙星体外作用于绿脓杆菌的实验。对于抑菌万分的去除,中国药典1995年版规定了4种方法,其中的微孔滤膜过滤法是液体类制剂和抑菌作用较强的抑菌药物的首选方法。对滤膜取出后如何进行菌数检查的方法报道主要有洗脱法、浇入法和贴膜法等。由于滤膜和微孔对细菌具有较强的吸附和嵌顿作用,故洗脱法不甚理想;而浇入法不利于滤膜上需氧菌的生长;贴膜法相对较好,但要肉眼数菌落,步聚繁琐,费时费力。现针对氧氟沙星抑菌效果原测试,设计并进行了微孔滤膜过滤比浊法实验,同时用菌数计数法做比较。

1 实验部分

1.1 仪品、材料和试药

紫外分光光度计;恒温摇床;电子天平;扫描电镜;CO2临界点干燥仪;SAS统计学分析软件。微孔滤膜;绿脓杆菌。50ml灭菌注射器;氧氟沙星含量;1号液体培养基为蛋白胨10.0g,牛肉提取物3.0g,氯化钠5.0g,加水至1000ml,调PH7.01号固体培养基为体培养基1号加0.5%琼脂粉;2号液体培养基为蛋胨10.0g、氯化钠7.0g、牛肉膏5.0g、酵母粉3.0、磷酸氢二钾4.82g、磷酸二氢钾1.32gD—葡萄糖1.0g,加蒸馏水至1000ml,调PH7.00.9%灭菌生理盐水;MILLIQ水灭菌后备用;12%甲醛溶液。

1.2 方法

1.2.1 绿脓杆菌供试菌悬液    

取绿脓杆菌斜面培养物接种于1号液体培养基,于34℃摇床培养8h,用适量灭菌1号培养基稀释。

1.2.2 绿脓杆菌的检验

1组为0.45ml菌液加入0.05ml生理盐水,一并加入4.5ml2号培养基;2组(只加菌膜)为0.45ml菌液加入0.05ml生理盐水,微孔滤器过滤,以重量盐水同向冲洗,取滤膜加入4.5ml2号培养基;3组(菌膜加药膜)为0.05ml药液加入0.45ml生理盐水,取滤膜加入4.5ml2号培养基,并要国入处理方法同2组的菌膜;4组和5组为0.5ml药液加入4.5ml菌液,分别于作用1530min后每份取0.5ml用微孔滤器过滤,以生理盐水同向冲洗,取滤膜加入4.5ml2号培养基;6组和7组为取0.05ml药液加0.45ml生理盐水,加至4.5ml供试菌液混合,分别于1530min后每份取0.05ml过滤,以生理盐水同向冲洗,取滤膜加入4.5ml2号培养基;阴性对照为5ml2号培养基。每组均做3个平生,共计24支试管。24支试管于37℃恒温摇床中培养,3h后取出

菌数计数共5组,分别为原菌液梯度稀释。菌液受10倍、100倍稀释药液分虽作用1530min后,各组再稀释10\100倍,分别取适量涂于培养皿1号固体培养基。每组均做3个平行,37℃恒温培养箱培养12h

1.2.3 测定

微孔滤膜过滤比浊实验组每管加入0.2ml12%甲醛溶液,以阴性对照为空白,紫外分光光度计580nm处测吸光度。

   菌落计数组数肉眼可见单菌落数。

1.2.4 细菌的扫描电镜观察

比浊法测定均量后,取所有实验组培养液适量,3000r·min-1离心10min,沉淀用4%戊二醛固定,涂片经上升梯度乙醇脱水、CO2临界点干燥、离子溅射喷金镀膜处理,于扫描电镜下观察菌体形态。

2 结果

2.1 比浊法菌量测定的结果

通过对1组和2组的实验结果比较,可认为微孔滤膜对菌的截流效果很好,同时验证了薄膜的吸附和嵌顿对细菌生长的数目无显著影响。为验证和排除洗脱后滤膜上有残留药液的影响,设计了3组。通过对2组和3组实验结果的比较,可以认为经生理盐水洗脱之后,滤膜上不存在残留抑菌药液。同时证明4567组中的抑菌效果是药液和菌液在混合以后15min30min内产生的,而不是在后继的比浊培养过程中残留药液持续作用而导致的。

SAS统计软件分析,123组间无显著性差异,说明微孔滤膜过滤法可有效地截留细菌,经生理盐水洗脱之后,可以认为薄膜上不再残留药液。经检验,45组间无显著差异,说明氧氟沙星喷雾剂短时间作用后即有很强的杀菌效果。与其相比,67组间的差异较大。1组和4组间差异显著,说明氧氟沙星喷雾剂原液稀释10倍后杀菌效果非常显著。1组和6组间,差异显著,说明氧氟沙星喷雾剂原液稀释100倍后同样可达到显著的快速杀菌效果。

2.2 扫描电镜观察结果

对照组细菌菌体呈短棒状,长短均匀。原药液稀释10倍、100倍并作用30min后培养3h,细菌菌体细胞壁全部裂解、破坏。原药液稀释10倍作用15min有部分菌体显著缩短,但是细胞壁完整。药液稀释100倍作用15min,可见部分菌菌体显著加长,有的显著缩短。

2.3 菌落计数组

SAS统计软件分析,2345组和阳性对照组之间P<0.01,表明各实验组药液杀菌效果显著,且氧氟沙星喷雾剂短时间作用后即有很强的杀菌效果。23组间P>0.05,无显著差异;45组间P<0.01,差异较显著;2组与4组间P<0.01,差异显著;3组和5组间P<0.01,差异显著,说明杀菌效果与药液的浓度密切关联。

3 讨论

对消除含抑菌成分药物的抑菌作用,常采用滤膜洗脱法。由于滤膜和微孔对细菌有较强的吸附和嵌顿作用,因此最终实验结果不能真实反映抑菌成分的去除效果,而将滤膜直接加入液体培养基可以克服此缺点。

采用微生物比浊法,与平板计数菌落法相比,可得到同样的实验结果,且更简单快速、方便易行,可大大简化实验步聚和节约时间。微孔滤膜过滤比浊实验组中,通过对1组和2组长的实验结果比较,可以认为微孔滤膜对菌的截流效果好,同时验证了薄膜的吸附和嵌顿对细菌的生长数目无显著影响。为验证洗脱后滤膜上药液的残留情况,设计了3组。通过对2组和3组实验结果的比较,可以认为经生理盐水的洗脱之后,滤膜上不存在残留抑菌药液。同时也证明4567组中的抑菌效果是药液和菌液在混合以后15min30min内产生的,而不是在后继的比浊培养过程中残留药液持续作用所导致。考虑到喷雾剂用于鼻腔和口腔后由于作用部位分泌液的自然稀释作用,故将原药液做10倍和100倍的稀释。实验结果表明作用15min30min后,与对照组相比,其浊度难以检出,氧氟沙星的杀菌效果相当好。扫描电镜下观察,原药液稀释10倍作用3min后菌完全裂解。原药液稀释10倍作用15min和稀释100倍作用1530后,形态完整的杆菌的数目减少,视野可见部分菌裂解。

 因此微孔滤膜过滤和比浊法二者相结合不失为一种方便可行的体外杀菌实验方法。

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