您当前的位置:杀菌剂网技术文章 → 文章内容

利用发光细菌测定抗菌素的效价

发布:多吉利        来源:www.duojili.cn  

利用发光细菌测定抗菌素的效价

近年来应用发光细菌的发光系统来检测各种物质的报道日见增多,尤其在检测环境污染、有毒物质等方面应用较多。由于其快速易行,灵敏度高而日益受到得视。但在抗菌素效价的检测上,则尚未见报道。本文主要利用发光细菌的发光特性易受外界环境因素影响的特点,选用目前应用很广的几种抗菌素——四环素、多粘菌素、红霉素、卡那霉素和头孢霉素对发光细菌发光的影响作了研究,探讨化学结构不同、作用机制不一样的抗菌素对发光细菌发光的影响,提供快速测定抗菌素的效价的实验方法。

材料和方法

一   菌种:以明亮发光杆菌A2作为检测用菌种。该菌株的特性已有报道。

二   培养基:液体培养基按ELEY所提的,固体培养基照的。培养温度20℃。液体培养时,以100毫升三角烧瓶装培养液25毫升,或250毫升三解烧瓶装培养液60毫升。振摇培养至对数期收获细胞。

三    抗菌素的准备:四环素,标准品,以0.01N盐酸溶解后用蒸馏水配成1毫克/毫升。多粘菌素B,市售。以1%PH6.0的磷酸缓冲液配成2000单位/毫升。红霉素,标准品,以少量乙醇溶解后用PH7-8磷酸缓站液配成1毫克/毫升。书那霉素,市售。以0.05M PH6.0磷酸缓冲液配成1毫克/毫升。头孢霉素I,标准品,配法与多粘菌素相同。以上抗菌素溶液均保存于4℃冰箱中备用。

四    光强度的测定:用GDB——10M型光电倍增管。以其输出稳定的最大电压值作为发光强度的指标。方法:直接用培养后发光的细菌悬液测定其发光强度:方法:细菌细胞悬于含3%氯化钠的PH6.5磷酸缓冲液中。测定时温度20℃。每次测定均以抗菌素浓度为零的样品作为空白对照,以消去可能的自身波动,以空白对照的发光强度作为100%,其余样品的发光均依此析算为相对发光强度。

五    存活率的测定:在活菌计数时,待抗菌素作用时间一到,立即加入1000倍体积的磷酸缓冲液使停止作用,然后迅速稀释到适当的菌浓茺用涂布法平皿计数。

结果和讨论

一   方法:按接种量为每毫升8×105个细胞将发光细菌接种于液体培养基后立即加入不同浓度的抗菌素,振摇培养8-10小时后产生不同程度的抑光作用。抗菌素浓度大则抑制发光明显。结果表明,除头孢霉素外,四种抗菌素在此条件下完全细菌生长发光的最低浓度是较恒定的,它们完全抑制发光的最低浓度分别为:多粘菌素B 2单位/毫升;四环素0.2微克/毫升;红霉素25微克/毫各;卡那霉素40微克/毫升。参照各培养物的光密度,可见是由于抑制了细胞生长才引起了发光受抑制。头孢霉素I对明亮发光杆蓖A2的生长发光影响极弱,在剂量较小时完全无作用,10毫克/毫升以上时才产生可查沉的抑制作用。

     若以此法与传统的杯碟法相比较,除不能应用于头孢霉素外,其余四种抗菌素的作用均很显著,所需的时间也短得多,因而明亮发光杆菌可以作为一种新的检测用菌种,特别是以发光与否作为判别樗,操作快而灵敏度高。

二   方法

1    将细菌培养至对数中期,此时发光也很明显,用含3%氯化钠的PH6.5的磷酸缓冲液稀释成细胞悬液,细胞含量为每毫升107——108个。然后,在细胞悬液中国入不同浓度的抗菌素,每隔一定时间测定其发光强度。结果发殃,这五种抗菌素均在一定范围内可逐渐抑制发光细菌发光,并随时间的处长而作用增强,但产生作用的快慢、影响的程度有所不同。抑光作用以多粘菌素及四环素最为强烈,且国入后十分钟左右就产生显著的抑光作用,小剂量时也很明显。卡那霉素的作用不如多粘菌素强,而且约在0.5-1小时之后抑光作用才明显。红霉素要在较大浓茺、较长的时间才有明显的抑光作用。头孢霉素的作用也较弱,但产生作用要比红霉素快,通常二小时后抑制发光的作用逐渐减退,发光有回升的趋势。总观它们的抑光作用的大小为:多粘菌素>卡那霉素>四环素>头孢霉素>红霉素。

     有意义的是,多粘菌素、卡那霉素及头孢霉素等三种抗菌素,若以所用的抗菌素浓度与其相对发光强度作图,则两者呈线性关系。据此,可作为该三种抗菌素的快速检测,在1小时内即可获知其效价,其简便而迅速是其余已知的生物检测法所不及的。

2 影响检测的几个因素:

(1) 菌龄的影响:除头孢霉素外,其余四种抗菌素的抑光效果均与所用发光细菌的菌龄关系大。兹以四环素等的作用为例。显然,处于对数生长期的细胞对这几种抗菌素的抑光作用很敏感,以后逐渐减弱,至静止期则敏感性最差,至衰亡期则敏感性又略回升。这是与一般细菌的抗性规律相吻合的。由此看来,检测时选用对数中期的细胞是较好的。

(2) 菌浓度的影响:细菌悬液中的细胞数量即菌浓度对发光变化的影响以卡那霉素为例,对于同一种抗菌素浓茺,都是在较低的菌浓度时有较高的抑光效应。但菌浓度太低时,发光的自身减弱较大,影响测定的精确度,在我们的试验中看来,认为以107——108细胞/毫升的浓度比较合知。既有足够大的发光强度,又有较灵敏的反应。

3 抑光效应与悬液中细胞存活率的关系:

用平皿法活菌计数,考察了抑光产生后悬液中细胞存活及发光强度的对应状况,可见,在产生抑光效应之后,细胞存活率下降,说明是由于细胞死亡而导致发光的下降。所用的抗菌素浓度越大,作用的时间越长,相对发光强度也下降越多,则相应地存活的细菌也越少。

    因而,可以认为发光强度的下降,反映了由于抗菌素作用后细菌的死亡。这就为用本方法测定抗菌素效价提供了生物学意义。

<--EndFragment-->

济南多吉利工贸有限公司
百宜系列杀菌剂、防腐剂、防霉剂、消毒剂、抗菌剂
联系人:宋先生 电话13305313047