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天然植物防霉剂对纸张霉菌的抑制研究

发布:多吉利        来源:www.duojili.cn  

天然植物防霉剂对纸张霉菌的抑制研究

摘 要:从霉变的书籍中分离纯化了34种霉菌,对其中的3种主要霉茵进行了形态学和分子生物学鉴定,分别鉴定为球毛壳菌种、土曲霉种、烟曲霉种。研究了4种中草药的乙醇提取物对这3种霉菌的抑制效果,结果表明,丁香提取物效果最好,黄岑提取物其次,黄连提取物和芸香草提取物较差,可为研究开发低毒环保的抗茵纸提供参考。

关键词:霉变书籍;霉菌;鉴定;中草药提取物;天然防霉剂

书籍是人类文明的载体,有效地保证书籍纸张的安全,使它完整而长久地提供给读者是极为重要的。影响书籍纸张寿命、使其受损的因素很多,如人为因素、物理因素、化学因素、生物因素等,在诸因素中,最难防治且破坏力极大的当属生物因素中的霉菌,它是危害图书资料的罪魁。霉菌广泛存在于自然界,空气中含有大量的霉菌孢子,一旦落在物品表面,在适宜的条件下,生长繁殖,溶蚀纸张,造成纸张腐烂变质。因此,分离鉴定引起纸张霉变的主要霉菌,并研制能抑制相应霉菌生长的防霉剂对开发新型抗菌纸有一定的参考价值。近年的研究表明,一些天然植物及其提取物具有一定的防霉抑菌作用,从香辛料和传统中草药中提取有效抑菌成分成为研发天然植物型防霉剂的热点。

作者从霉变的书籍中分离纯化了34种霉菌,通过验证实验确定了导致纸张霉变效果最强的3种主要霉菌,对其进行了形态学和分子生物学的鉴定,重点研究了黄芩、黄连、丁香、芸香草等4种中草药的乙醇提取物对3种主要霉菌的抑制作用,以期寻找开发绿色环保、对人体无害的纸张防霉剂。

1 实验

1.1 菌种与材料

菌种从旧书店储存的各种霉变纸张中分离而得。黄芩、黄连、丁香、芸香草等购于襄樊中药材公司。实验纸为市售A4复印纸。

1.2 方法

1.2.1 纸张霉变菌种的分离与纯化

采用改进的生霉纸张分离法。将生霉的纸张剪成1 cm2的纸片,悬浮于无菌水中,制成混合的霉菌孢子悬液,取少量孢子悬液涂布于添加有50ug·mL-1氨苄青霉素(以抑制细菌生长)的PDA培养基平皿上,3O℃培养5~7 d。在初筛的霉菌平板上挑取形态单一的菌落,在新鲜的察氏培养基上划线培养获得纯培养物。

1.2.2 纸张霉变的验证

用斜面菌种加无菌水制备孢子悬液;然后用脱脂棉过滤除去菌丝体、培养基等杂质;用血球计数板对其

统计,控制在1×10 ~1×10。个·mL-1左右;最后取4.5 mL孢子悬液均匀喷涂在无菌的A4复印纸上,并置于无菌的培养皿中于29℃ 培养,每天观察记录生霉情况。

1.2.3 纸张霉变优势菌种的鉴定

1.2.3.1 形态学鉴定

取一灭菌的载玻片,放人培养约4~6 h的霉菌平板的顶盖问,等到菌丝体长满整个平板时,取出载玻片,在正中央滴乳酸石灰酸棉蓝染色液,盖上盖玻片。置于显微镜下观察,进行形态学的鉴定。

1.2.3.2 分子生物学鉴定

(1)霉菌总DNA的提取

采用改进的CTAB法,离心收集29℃ 培养3 d的霉菌培养物,分别用生理盐水和20 mmo1.L-1ED一TA离心洗涤后,用液氮研磨霉菌菌丝体,分装于1.5mL的EP管中,向其中加入70OuL CTAB母液、2%的β-巯基乙醇和4%的PVP.65℃水浴2 h,加入1O0uL 3.5 mo1.L-1的NH4 Ac,冰浴3O min,10 OOO r·min 离心5 min,取上清,加入等体积的酚:氯仿;异戊醇(25:24:1)混合液,8OO0 r·min 离心5min,抽提2次,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)混合液,80O0 r·min 离心5 min;取上清,加入等体积的异丙醇,1O OO0 r·min 离心1O min,弃上清;70%乙醇离心洗涤沉淀2次,干燥后融于dd H20中,一20℃保存,采用0.7%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

(2)ITS(Interna1 transcr ed spacer)序列分析用通用的ITS引物l7 进行PCR扩增rDNA—ITS:ITS1:5一TCCGTTGGTGAACCTGCGG一3;ITS4:5一TCCTCCGGTTATTGATA TGC一3;

PCR反应条件:94℃ 预变性2 min;94℃ 变性3Os,58℃ 复性30 s,72℃ 延伸30 s,共3O个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物用1.0 琼脂糖凝胶电泳检测,胶回收纯化目的片段,连接至pMD_18T 载体,转化大肠杆菌DH5a,经菌落PCR、质粒酶切鉴定的阳性克隆,送武汉思特进测序公司测定碱基序列。以NCBI数据库中Blastn程序比对分析。

1.2.4 中药提取物的制备

各取1OO g的黄芩、黄连、丁香、芸香草分别浸泡于15O mL 75 的酒精中7 d,无菌过滤后获得中药提取物,将此浓度定为1。稀释获得3/4、1/2、1/4、1/8、1/16倍的系列溶液,分别进行抑菌测定,每组设5个重复,培养6O h后测量抑菌圈大小,计算平均值。

1.2.5 抑菌实验

采用霉菌抑菌圈法。向无菌的培养皿中分别注入O.1 mL各霉菌的孢子悬浮液(1×10 个·ml),

均匀涂布;向各培养皿内注入约l5~2O mL溶化状琼脂培养基(约45℃),轻轻转动,使培养基与菌液混匀,将浸有中药提取物的直径为2O mm 的圆形滤纸片放置在培养基表面中央,29℃ 培养6O h后,观察滤纸圆片周围抑菌圈的有无及大小。

2 结果与讨论

2.1 纸张霉变优势菌种的分离纯化

通过多次分离纯化,利用生霉纸张分离法从霉变的书籍纸张中共分离纯化了34种霉菌,利用A4打印纸对其进行了纸张生霉的验证实验。

4 菌株的致霉变效果最明显,其次是5#菌株、12#菌株,这3株菌时导致书籍纸张生没变的 有时菌种,后续的研究均以这3中霉菌为主要研究对象

2.2主要霉菌的鉴定

4#菌株在PDAP培养机上的菌落初为白色,渐变为暗青色,菌丝交织,透明有隔,孑然呈棍棒状,纺锤形,倒卵行和细圆柱状,孑囊孢子无隔,单细胞,呈球状,椭圆形或柠檬形等,成熟前多为灰白色,成熟后呈棕色或橄榄绿色,与《真菌鉴定手册》中对毛壳属的形态描述极为相似 ,5#菌株的菌落黄绿色,疏松分布,气营养菌丝根状,有隔,分升孢子穗长而呈紧密的直柱状,分生孢子梗较大且短,弯曲,光滑, 无色,顶端膨大,与《中国真菌志》(第五卷)曲霉属土曲霉种形态描述极为相似,12#菌株的菌落呈戎状或一定的絮状,形如烧瓶,分生孢子成熟是为致密圆柱体,分生孢子球星与《中国真菌志》(第五卷)曲霉属烟曲霉种形态描述极为相似

2..2.2分子生物学鉴定

(1)PCR是内源转录间隔区,位于rPNA编码基因18s、5.8s和28s之间的小基因片段,序列保守,ITS分析法于1990年提出后逐步发展成为全新的分子标记方法,这个试验利用ITS通用引用进行PCR扩增以或得真菌进行鉴定。

(2)ITS序列分析

将PCR产物回收,经克隆后测定碱基序列,提交所得的ITS RDNA 序列到GenBank数据库,利用Blastn工具进行序列比对,对3中霉菌进行鉴定,结果表明,4#菌与NT-166001.1(chartomium globosum CBS 148.51)相应序列,5#菌与NT-165929.1(AS-pergillus terreusNIH 2624)相应序列、12#菌与NC-007197.1(aspergillus fumigatus af 293)相应序列的相似性分别为92%96%和94%,虽然形似性不是最高,但是结合形态学进一步发呢西,逐步排除相似性类似的其他菌种,最终将3中霉菌分别鉴定为球毛壳菌种(chaetomium globosum)土曲霉菌种(aspergillus terreus)烟曲霉菌(aspergillus fumigatus)

 霉菌时一类寄生真菌,在书库中可见到霉菌月200多种,目前鉴定的危害图书资料的微生物种类有13个属,5个组,3个种,其中根霉属。毛霉属 木霉属 灰绿曲霉组,黑曲霉组,扩张青梅组,卷顶毛壳菌,球毛壳菌,卷曲毛壳菌和多种细菌等时危害图书资料的罪魁,大部分霉菌没有鉴定到种

2.3中草药提取物的防霉效果

不同浓度的中草药提取物对3种霉菌的抑制效果 中数据均为最大抑菌圈宽度,以抑菌半径=(最大抑菌圈直径一滤纸片直径)÷2表示,其中滤纸片直径为20 mm。每种菌的实验设5个平行,重复3次,取平均值。

丁香对3种霉菌均有较强的抑制效果,尤其是对4 菌抑制效果最强,在1/16的浓度下仍有明显的抑菌圈,抑菌效果随着浓度的降低而降低,最低抑菌浓度为83.3 mg·mL-1;黄岑在高浓度(>3/4)下对3种霉菌均有一定的抑制效果;浓度相同时,黄岑的抑菌效果仅为丁香的1/3左右,要提高黄岑的抑菌效果,必须提高提取物的浓度,浓度达333.3 mg·mL-1时对3种霉菌也有较好的抑制效果;黄连和芸香草只对部分霉菌有抑制效果,前者对4#和12#菌有效、后者对5 菌有效,黄连相对抑菌效果较好。为丁香对3种霉菌的抑制效果,中间是滤纸片,外围是生长的霉菌。另外3种中草药的抑菌圈图略。

3 结论

利用生霉纸张分离法分离纯化了34种霉菌,并通过纸张发霉验证实验确定了3种优势菌种,对其进行了形态学和分子生物学的鉴定,分别鉴定为球毛壳菌种、土曲霉种、烟曲霉种。针对这3种优势霉菌研究了中草药提取物的抑菌效果,结果表明丁香提取物对3种霉菌均有较强的抑制效果,最低抑菌浓度为83.3 mg·mL-1;黄岑提取物其次,浓度达333.3 mg·mL-1时对3种霉菌也有较好的抑制效果;黄连对球毛壳菌和烟曲霉有较好的抑制效果,芸香草提取物抑菌效果最差。本研究结果对于低毒、绿色环保的抗菌纸开发具有重要的参考价值。

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