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脂质体灭菌方法综述

发布:多吉利        来源:www.duojili.cn  

脂质体灭菌方法综述

脂质体作为药物载体具有多样性,脂溶性药物和水溶性药物都能以较高的浓度载入脂质体中,且脂质体可以生物降解,毒性低,生物相容性好,其作为药物载体已被广泛研究。在一些治疗领域中,脂质体已经成功用于药物的缓控释和定位传递。已上市的注射用脂质体制剂有AmBisome两性霉素B脂质体、DaunoXome柔红霉素脂质体、My℃et多柔比星脂质体、Doxil多柔比星隐形脂质体、Dep℃yt阿糖胞苷多囊泡脂质体以及DepoDur硫酸吗啡多囊泡脂质体等,还有很多脂质体制剂已进入临床研究阶段。为保证产品的质量和使用时的安全性,用于注射的脂质体最终需要经过灭菌步骤或者无菌操作过程,这就使其大规模生产复杂化。脂质体的物理和化学不稳定性,使灭菌成为注射用脂质体产业化的难点。现根据近几年的研究,综述脂质体可能适用的几种灭菌方法或无菌操作。

1脂质体的不稳定性

1.1化学不稳定性

即使在没有特异的氧化剂存在下,磷脂的脂肪酸链也能被痕量的过渡金属、辐射或者声裂催化氧化。脂质的不饱和度越高越易氧化形成自由基。脂质氧化会影响脂质和脂质体的性质,使双分子层的流动性增加。磷脂易于水解,特别是在水分散相中,脂质水解成游离脂肪酸与2-酰基和3-酰基溶血磷脂。

1.2物理不稳定性

脂质体易发生的物理变化包括聚集或融合、沉淀、药物损失。这些不稳定性能被化学变化诱导的双分子层缺陷,被加热、冷冻以及相转变等物理因素所诱发。

2灭菌

2.1高压灭菌

脂质体的高压灭菌存在着脂质体或包封药物的物理和化学变化,以及包封药物损失的风险。

Kikuchi等制备了不同脂质组成的多种脂质体,并将其在121℃下灭菌20min。观察发现,在生理盐水中热力灭菌后脂质体发生聚集,而在等渗的糖或者多元醇溶液中则不聚集。含有高过氧化值的蛋黄磷脂(EggPC)的脂质体分散相,在热力灭菌后略显淡黄色,而使用低过氧化值的蛋黄磷脂、氢化蛋黄磷脂(H—EggPC)或者二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)则无颜色变化。在中性pH下通氮气也能防止颜色变化。在热力灭菌过程中,带阴离子的6-羧基荧光素从负电荷脂质体(EggPC/胆固醇/蛋磷脂酰甘油)中泄漏,而其在热力灭菌和长期储存过程中都未从正电荷脂质体(EggPC/胆固醇/硬脂酰胺)中泄漏。因此,若由低过氧化值的脂质形成的荷电脂质体分散在pH接近6.5的等渗的糖或多元醇溶液中,溶液中溶解氧的量降到最低,且若是离子型水溶性药物则包载在带相反电荷的脂质体中,则对其进行热力灭菌是可行的。

Zuidam等对由蛋黄磷脂或饱和磷脂构成的脂质体,在等渗的醋酸盐缓冲液(pH4.0)或Hepes缓冲液(pH7.4)中进行高压灭菌。在一个标准的高压灭菌周期(121℃,15min)后,pH值、粒径以及氧化程度都未检测到有变化,而磷脂的水解则因pH值的不同而有所不同。包载的水溶性化合物(钙黄绿素)以及两亲性化合物(阿霉素)在一个灭菌周期后出现明显的泄漏;而亲脂性化合物[氟乙酰基阿霉素(AD一32)和Ot.生育酚]高压灭菌后仍然保留在脂质体中,但是观察到AD一32大量降解。故热稳定的亲脂性药物可在具有适当pH值的介质中高压灭菌。

Lukyanov等在高压灭菌下研究脂质体的稳定性和氧化情况。研究表明,将脂质体样品中的原有气体移除后,在高压灭菌过程中没有出现脂质氧化和内容物的泄漏。包载色甘酸钠的脂质体移除气体后,在120℃下经高压灭菌15min后仍然保持完整。

Tardi等以羧基荧光素作为亲水性标记物,采用400mg·g。蛋黄磷脂高压匀浆制得囊状磷脂凝胶剂(vesicularphospholipidgels,VPGs,囊状的高度浓缩的半固体磷脂分散相)。VPGs经高压灭菌(121℃,15min)后发现,曲率不适宜的小囊泡(20nm)融合导致脂质体粒径增大以及囊泡基质填充密度相对增加,造成羟基荧光素的包封率增加,体外释放减慢。在高压灭菌过程中,形成的溶血磷脂小于2%,磷脂的水解可以忽略。灭菌后的VPGs再分散成脂质体分散相,静脉注射后仅影响药动学行为,但不产生安全性问题,即被认为可高压灭菌。如果高压灭菌过程中VPGs的形态学和功能变化可以得到很好地重现,则可据此设计以VPGs为基础的缓释系统,以VPGs为媒介,经高压灭菌后再稀释成脂质体分散相。

Cereda等采用高压灭菌法(12l℃,15min)对丙胺卡因单室脂质体制剂(蛋黄磷脂/胆固醇/

d一生育酚)进行灭菌,并且评价了灭菌前后制剂的物理化学稳定性。以激光散射法测定脂质体的粒径来评价其物理稳定性;以硫代巴比妥酸比色法评价脂质氧化,以H.NMR图谱评价丙胺卡因分子的稳定性。结果表明:灭菌和非灭菌样品的粒径之间无显著性差异,都可稳定达30d,但是60d后,两者的粒径都有所增加;脂质可稳定达60d,灭菌和非灭菌样品之间无显著性差异;丙胺卡因的H.NMR图谱在灭菌前后无差异。该制剂可稳定达30d。

2.2过滤灭菌

过滤灭菌仅适合于粒径在200nm以下的脂质体以及低粘度的分散相,且需较高的压力(25kg·cm。)。也有文献报道在高于相变温度下过滤,由于脂质膜在液晶态下柔性增加,大于0.2m的脂质体也能滤过。

Goldbach等将包载羧基荧光素的多室脂质体移除游离药物,且经过0.1、0.2或0.4m孔径的聚碳酸酯膜使粒径均匀化后,采用塑料注射器使其通过由聚碳酸酯(Nuclepore)、醋酸纤维素(Mini—sart@)或聚偏氟乙烯(PVDF)(Millex~-GV)构成的消毒过滤器。脂质体易于滤过,且粒径无显著变化,也无磷脂损失。包载物的泄漏很轻微,低于5%,除了粒径300nm的脂质体滤过0.2um聚碳酸酯膜时泄漏率大于5%。

Li等以冷冻干燥单相溶液的新方法制备脂质体。将脂质和水溶性载体材料溶解在叔丁基醇/水共溶剂中,形成均匀的单相溶液,将形成的溶液通过0.2um的滤器过滤灭菌,然后低压冻干。加入水后,冻干制品可自发形成均匀的脂质体制剂。采用该方法可制备无菌无热原的具有狭小粒度分布的亚微粒脂质体。

Wang等采用冷冻干燥复乳的方法制备亚微粒单室脂质体,内水例和外水相都含有二糖作为冻干保护剂。采用不同的磷脂或者脂质混合物作为乳化剂,通过两步乳化法制备复乳,然后将它们通过0.22um微孔滤器过滤灭菌,低压冻干。冻干制品的再水化形成的脂质体具有相对较高的包封率(钙黄绿素,87%;氟比洛芬,93%),经动态光散射仪和原子力显微镜测得粒径在200nm以下。在冷冻蚀刻电子显微镜图上和x一射线衍射图上观察到脂质体是单层的。该技术可用于制备可重建的灭菌亚微粒单室脂质体,并具有相对较高的包封率。

2.3γ辐照灭菌

γ辐照是脂质体的可以选择的灭菌方法,其主要问题在于可能引起脂质和药物的辐射损伤以及产生毒理学方面的问题。

Zuidam等将平均粒径为0.2um的脂质体,在氮气气氛中以高达5×104Gy的剂量辐照灭菌。

(DPPC/DPPG:10/1)的脂质体和(EPC/EPG:10/1)的脂质体在不含海藻糖的10mmol·L磷酸盐缓冲液中(pH7.4),经γ辐照后大量降解。而在含10%海藻糖作为冻干保护剂条件下,辐射损伤减少。但是海藻糖与γ辐照的诱导产物反应,导致pH值大大下降,因而限制了冷冻或冷冻干燥脂质体分散相作为降低辐射损伤的方法的使用。γ辐照后脂质体的粒径没有发生变化,双分子层的刚性也几乎无变化。在10%海藻糖存在下,(DPPC/DPPG:10/1)脂质体的相变温度在γ辐照前后差异很小,但在无海藻糖的情况下,差异变大。

Zuidam等叫将由饱和磷脂DPPC、DPPG或两者的混合物组成的脂质体在大气环境下进行γ辐照。以残留DPPC或DPPG的浓度的对数值对照射剂量作图得一直线。直线的斜率(总降解常数)依赖于磷脂的种类、脂质体的浓度、脂质体的粒度。

在所选择的条件下,DPPG加入到DPPC脂质体中不影响DPPC的降解速度常数,反之亦然。磷酸盐缓冲液(pH7.4)或氯化钠的存在,也不影响辐射损伤,总脂肪酸的变化较小,而磷脂的降解较多。经动态光散射和以l,6-联苯一1,3,5一己三烯(DPH)为探针的荧光各向异性检测表明,γ辐照既不影响脂质体的粒度,也不影响双分子层的刚性。但是,γ辐照后,DSC结果显示脂质体的熔化性质发生变化,脂质体双分子层的预相变熔化焓降低或消失,主相变的峰形变宽。

Samuni等以4个不同脂质组成(物质的量之比,DPPC:DPPG=10:1;DPPC:DPPG:胆固醇=10:1:4;EPC:EPG=10:1;EPC:EPG:胆固醇=10:1:4)制备脂质体,γ辐照剂量为32kGy,由HPLC法和GC法测定脂质降解,粒度和DSC检测脂质体分散相的物理变化,评价200nm脂质体的辐射损伤以及氮氧自由基(2,2,6,6一四甲基哌啶.N.氧基(Tempo)和4一羟基一2,2,6,6一四甲基哌啶.N.氧基(Tempo1))的保护作用。结果表明:5mrnol·L。Tempo或Tempol的加入,或样品的冷冻抑制了辐射诱发的脂质降解;Tempo和Tempol未引起脂质体分散相的物理和化学变化,并且阻止或减少了由辐射诱发的脂质体向温性特性的一些变化,也阻止了主要相变温度的变化。

γ辐照会产生辐射分解产物,如溶血磷脂、游离脂肪酸、磷脂酸和各种碳氢化合物,因此必须对其进行毒理学研究。Stensrud等对脂质体的组成和γ辐照对于脂质体与止血机制(溶血、血小板聚集和凝固)相互作用的影响进行了体外研究。未被辐照的脂质体混悬液没有出现红细胞的溶血,但是在辐照后,测到了最高达3.1%的溶血。溶血最少的是由不饱和或荷电磷脂组成的经辐照的脂质体。带负电荷的DSPG一脂质体(未受辐照的和受辐照的)诱导了微弱的但可逆的血小板聚集。带负电荷的脂质体也影响了凝血连锁,延长了凝血时间,且经辐照后,凝血时间更长。同时,他们还研究了脂质体组成和辐照对于脂质体与培养细胞相互作用的影响。研究表明,由不饱和磷脂组成的脂质体对细胞系产生毒性效应,γ辐照后毒性效应增加。而由饱和磷脂组成的脂质体没有显示任何毒性效应,且辐照不影响其递送药物的性质。

由于化学降解以及随之而来的大量降解产物的存在,可能会限制γ辐照作为水性脂质体制剂的灭菌方法的使用,因此希望在脂质体制备前灭菌固体磷脂或者在水合前灭菌低压冻干的产品。Stensrud等研究了γ辐照(25kGy)对固态或冷冻干燥的磷脂(DSPC和DSPG)的影响。对固态/冷冻干燥磷脂进行物理化学分析(pH、rrIR31P—NMR、TGA、DSC、X—ray),并对随后制备的脂质体进行物理表征(Zeta电位、粒度/扩散常数、浊度、粘度、相变行为)031P—NMR表明磷脂的化学降解较少,但是观察随后制备的脂质体发现较低的动力学粘度和假塑性,较低的浊度,较高的扩散常数,较小的粒径,更大的负性Zeta电位以及相变行为的变化。这些变化某种程度上可以由辐照诱导的降解产物(二硬脂酰磷脂酸、脂肪酸、溶血磷脂)所解释。

目前,γ辐照灭菌已被较为广泛的应用。Stenstud等采用pH梯度法以DSPC和胆固醇为脂质制备伯氨喹小单室脂质体。为了达到长期稳定和无菌,将脂质体低压冻干,再进行γ辐照。在该处理过程中,pH梯度得以保持,且几乎无化学降解产物。

郑宁等对依托泊苷脂质体用4kGy和6kGy的60CO灭菌,发现4kGy时,其颜色同未灭菌时一样,而6kGy时,颜色稍有变黄,两种强度灭菌后15d基本无渗漏,而灭菌后30d和60d时,6kGY的脂质体渗漏率偏高。Mzal等将包载分支杆菌融合蛋白Ag85B.ESAT.6的DDA/TDB脂质体,在冷冻保护剂存在下冷冻干燥,以Cs为辐射源进行25kGy的辐照灭菌,而没有引起脂质成分、脂质体和包载抗原的显著的物理、化学、生物学性质的变化。E1-Ridy等根据磷脂物质的量之比(二棕榈酰磷脂酰胆碱:胆固醇=7:2,电中性;二棕榈酰磷脂酰胆碱:胆固醇:联十六烷基磷酸盐=7:2:1,荷负电)采用涡旋分散法制备吡嗪酰胺(PZA)脂质体。以60co为辐射源在两种辐照剂量15kGy和25kGy下γ辐照灭菌,无菌检查结果表明25kGy下实现无菌,稳定性试验表明,在两个辐照剂量下脂质体囊泡内的PZA滞留没有显著变化,说明γ辐照是安全的,对脂质体的完整性无不利影响。Botelho等对大生产中的抗分支杆菌脂质体制剂的辐照进行验证。以60co进行辐照灭菌,在12kGy和15kGy剂量下辐照达到10SAL,γ辐照的最大剂量需低于23kGy。

2.4无菌操作

当上述方法都不适用时,如对热敏感的脂质体,则应进行无菌操作。

SkyePharma公司以DepoFoam技术为基础开发研制了阿糖胞苷多囊脂质体(DepoCyt@)和硫酸吗啡多囊脂质体(DepoDur⑧)。多囊脂质体在结构上不同于常规脂质体,内部脂膜以非同心圆形式存在,外观像泡沫,粒径更大(5~100umm,中间粒径为10~30um),不适合于终端灭菌,因此在制备时必须要无菌操作。多囊脂质体的制备采用复乳化方法,其工业化大生产过程的流程。制备多囊脂质体的第一步是将含有药物的第一水相与含有脂质的有机溶剂进行混合乳化,形成水包油型乳剂。第二步,将初乳与第二水相机械混合形成混悬在第二水相内的溶剂小球。第三步,通过蒸发、减压或者氮气流移除小球中的有机溶剂,形成了MVL。最后再通过交叉流滤过交换缓冲液,除去未包封的药物。

Tur6nek等采用前体脂质体一脂质体方法,将自制的搅拌恒温室与快速蛋白液相色谱(fastproteinliquidchromatography,FPLC)系统连接,在严格控制的条件下(无菌、恒温度、恒速)快速自动地制备多室脂质体。恒温套能够容纳一个离心管(50mL),使用两个O形环密封离心管。将前体脂质体混合物(脂质/乙醇/水)转移到灭菌的离心管中(60%乙醇,60℃,灭菌15min)。稀释液用聚四氟乙烯树脂毛细管(1.8mm外径×0.5mm内径)递送,并用无菌滤器(0.22um,Millipore)滤去残留颗粒和微生物,以确保制剂的无菌。磁力搅拌器固定在毛细管的凸端。带有涡轮状叶片的搅拌器伸到试管的圆锥形部分。另一个无菌滤器靠近压力补偿孔,保证内部不受空气中污染物的影响。快速蛋白液相色谱系统的作用,是实现稀释液的精确流速的程序控制。Tur6nek等采用此装置分别制备了合成免疫调节剂adanmntylamidedipep.tide(AdDP)、muramyldipeptide(MDP)、B.D—Glc—NAc—norMurNAc—L—Abu-D—isoGln(DDD)脂质体,抗生素庆大霉素、新霉素脂质体以及光敏剂四苯基卟啉磺酸盐脂质体,其包封率分别为87%、62%、85%、69%、65%、65%;且经血浆琼脂培养(37~C,96h),结果显示制剂未受细菌污染。

2.5其他灭菌方法

Ratz等将制得的碘曲仑脂质体低压冻干后用环氧乙烷灭菌。在冻干前加入冻干保护剂,以保持脂质体的粒径。当每克脂质采用4g海藻糖时,冻干和灭菌对样品的形态学性质无不利影响。灭菌后7d,在任何样品中均无微生物生长。

3结语

脂质体的物理和化学不稳定性造成了脂质体产业化过程中灭菌的困难。因此在灭菌方法的选择上,需多方面考虑:灭菌后引入的磷脂化学降解产物的毒性,药物的泄漏情况,脂质体形态学的变化等。可以通过选用合适的磷脂种类、脂质组成、介质pH值、采用冷冻干燥、气体保护或运用新的制备方法、制备前体脂质体等,以减少灭菌困难。对于不能最终灭菌的脂质体必须在无菌条件下制备,需要进行系统认证、灭菌过程认证、体外药物释放、灭菌保证、多种标准和规范、设备配置和现行GMP适合性的验证。有文献报道,超临界二氧化碳有望作为灭菌剂,但其实用性需进一步研究。

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